Hoefer IEF100 - Handbuch (Seite 58)

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Allgemeine Richtlinien
• Probenvorbereitungsverfahren werden weiterentwickelt und stan-
dardisiert. Am besten ist es, die Literatur zu bestimmen, ob eine
bestimmte Probe Herstellung Puffer für die Probenart empfohlen
konsultieren.
• IEF funktioniert am besten mit reinem Protein-Proben, die solubilisi-
ert und denaturiert werden und frei von störenden Moleküle.
• Entfernen unlöslichen Materials mit Zentrifugation.
• Halten Sie den Salzgehalt so gering wie möglich.
• Verwenden Sie frisch zubereiteten Reagenzien von hoher Qualität,
oder Reagenz-Lösungen, die gespeichert wurden eingefroren.
• Lassen Harnstofflösung bei Raumtemperatur für einen längeren
Zeitraum.
• Nie erhitzen Proteinproben in Harnstoff-Lösungen. Heizung Ursa-
che Carbamylierung von Proteinen und verändern die nativen
Ladung der Proteine .
• Bewahren Sie Proben auf Eis, um den Abbau zu verhindern.
• Fügen Protease-Inhibitoren Protease-Aktivität zu verhindern. Prote-
ase-Inhibitoren, wie zB PMSF oder Pefabloc zugegeben werden, um
Serin-Protease-Aktivität zu hemmen, während Pepstatin Aspartyl-
proteasen hemmen kann.
• Einige Protokolle verwenden grundlegende Trägerampholyten oder
Tris, einen hohen pH-Wert im Probenpuffer erhalten. Dies hilft
solubilisieren einige Proteine und senkt die Enzymaktivität, die die
Proteine angreifen würde.
• DNA und RNA können häufig durch Ultrazentrifugation entfernt
werden. Die Probe kann auch mit DNase und RNase-Lösung zum
Abbau der Schadstoffe behandelt werden.
• Denken Sie daran, dass einige Protease-Inhibitoren, DNase und
RNase-Proteine sind sich selbst und kann zeigen, bis auf einer
2D-Karte.
• Das Wasser für die Herstellung verwendeten Reagenzien sollten von
höchster Qualität zur Verfügung stehen. Wasser mit einem spezi-
fischen Widerstand von >5 Megaohm-cm ist am besten. Wasser
durch Umkehrosmose oder entionisiertem Wasser gereinigt ist
akzeptabel.
Hinweis: Die Salze sind vielleicht die
häufigste Verunreinigung verursacht
schlechte Ergebnisse IEF.