Eppendorf Eporator - Handbuch (Seite 25)

Problembehebung
Eppendorf Eporator®
Deutsch (DE)
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6 Problembehebung
6.1 Allgemeine Fehler
Es gibt viele Faktoren, die zu einer geringen Transformationseffizienz beitragen können:
• Die eingestellte Spannung: Für jeden Mikroorganismus existieren spezifische
Spannungsparameter. Während der Elektroporation sterben einige Zellen ab. Ist die
Feldstärke zu hoch oder zu niedrig, erhält man eine geringe Transformationseffizienz.
Die erwarteten Überlebenswerte variieren zwischen 20 und 80 % der eingesetzten
Zellen. Die Elektroporation von E. coli erfordert einen Impuls von etwa 5 ms und
Feldstärken zwischen 12 kV/cm und 19 kV/cm. Zur Optimierung der Bedingungen
sollten Sie die Transformationseffizienz unter verschiedenen Spannungen prüfen.
Auf der Eppendorf Homepage www.eppendorf.com finden Sie Applikationsprotokolle
für die Elektroporation einer Vielzahl von Bakterien- und Hefestämmen.
• Die Zellen: Zellen werden in der Regel am effizientesten transformiert, wenn sie sich
in einer frühen bis mittleren log-Phase befinden. Unterschiedliche
Wachstumsbedingungen können die Transformationseffizienz verbessern (siehe
Wachstum und Aufbereitung von Zellen auf S. 17).
Werden zu viele Zellen getötet, müssen die Bedingungen der Elektroporation für den
Stamm optimiert und die DNA-Präparation und die Zellaufbereitung auf toxische oder
organische Substanzen untersucht werden (siehe DNA-Präparation auf S. 16).
Sie müssen Zellen (insbesondere E. coli) unmittelbar nach der Elektroporation in ein
reiches Medium übertragen, um gute Ergebnisse zu erzielen. Schon eine geringe
zeitliche Verzögerung dieser Maßnahme kann zu einer erheblich verringerten
Transformationseffizienz führen (siehe Regeneration der Zellen auf S. 20).
• Die DNA: Sie sollten die Quantität und die Qualität der verwendeten DNA vor der
Elektroporation überprüfen. Falsch konzentrierte oder degradierte DNA führt zu einer
geringeren Transformationseffizienz.
Salze oder andere Bestandteile, die auf Zellen toxisch wirken könnten, müssen Sie vor
dem Aufbereitungsverfahren aus der DNA-Präparation entfernen.
Sie sollten die DNA-Präparation nicht länger als eine Minute vor der Elektroporation
zu den Zellen geben. In der Zellaufbereitung vorhandene DNasen können die DNA
abbauen und somit zu einer niedrigen Transformationseffizienz führen (siehe
DNA-Präparation auf S. 16).
• Die Temperatur: Sie sollten die Elektroporationsküvetten vor der Elektroporation auf
0 °C - 4 °C kühlen (siehe Temperatur auf S. 18). So erzielen Sie bessere Ergebnisse als
mit Elektroporationsküvetten, die Raumtemperatur haben.
Sofern gefrorene Zellen verwendet werden, sollten Sie diese unmittelbar nach dem
Auftauen der Elektroporation unterziehen. Gefrorene Zellen können Sie maximal 6 - 12
Monate in 10 % - 15 % Glycerin bei -80 °C aufbewahren.