Hoefer PR625 Immunoblot - Handbuch (Seite 15)

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Schritt 2.
Nachdem die Gele geblottet werden, werden die
Bänder auf der Membran nicht sichtbar. Hinzufügen
eines nicht-reaktiven Farbstoff macht es leicht, um
die Membran auszurichten. Dies kann in einer von
zwei Möglichkeiten:
A. Für größere Lasten Protein (>250 ng) Ponceau S
kann verwendet werden, um die Proteine reversibel
Fleck auf der Membran nach elektrophoretischer
Transfer werden.
Spülen Sie die Membran kurz in Wasser und Flecken
in 0,2% Ponceau S für 1 bis 2 Minuten, dann in
mehrere Änderungen von destilliertem Wasser entfär-
ben, bis rote Bänder vor einem weißen Hintergrund
erscheinen. Da der Fleck bei der anschließenden
Sperrung Schritt verloren geht, sollte Proteinbanden
in diesem Stadium mit Nadelstichen und mit einem
spitzen Bleistift markiert werden. Der Blot kann auch
fotokopiert werden.
Ponceau S angefärbten Blots kann über Monate
bei 4 °C gelagert werden, feucht gehalten zwischen
Lagen Paraffin oder Puffer gesättigt Filterpapier.
Blots können auch in einem Plastikbeutel eingefro-
ren werden.
Ponceau S-Pulver sollte in destilliertem Wasser gelöst
werden, um eine funktionierende Lösung zu machen.
Die Lösung kann für mehrere Wochen bis Monate
abhängig von der Anzahl der gefärbten Membranen
verwendet werden.
B. Für niedrigere Protein Lasten (<250 ng), kann
Methylgrün, Pyronin Y oder Deep Purple verwendet
werden, um dauerhaft markieren den oberen und
unteren Rand des Gels für die anschließende Flucht
mit den ImmunoBlot Kanäle werden.
Beim Laden des Gels, können etwa 5 µl Methylgrün
(0,1% ige Lösung in 50% Glycerin) oder Pyronin Y
(0,05% ige Lösung in 50% Glycerin) zu den gewün-
schten Spuren. Diese Farbstoffe knapp vor der Farb-
stoff Bromphenolblau Front im Gel wandern, und
wird dauerhaft zu übertragen, um die Membran. Ein
zweites Aliquot des Farbstoffes auf das Gel in der
Nähe des Endes des elektrophoretischen Lauf wird die
Trenngel in 5 bis 10 Minuten ein und dienen dazu,
die oben auf dem Gel zu markieren. Bitte beachten
Sie, dass diese Farbstoffe können mit fluoreszier-
enden Western-Blot-Nachweisverfahren stören und