Jenway Genova Plus German - Handbuch (Seite 16)

KAPITEL 3 – Theorie und Praxis von spektroskopischen
Messungen
3.1 THEORIE DER SPEKTROSKOPISCHEN MESSUNGEN
Die UV/Vis-Spektroskopie ist die Messung der Lichtabsorption bei einer bestimmten Wellenlänge in einer Probe. Sie
dient zur Identifizierung des Vorhandenseins und der Konzentration von molekularen Entitäten in einer Probe. Das
Lambert-Beersche Gesetz setzt die Lichtabsorption in Beziehung zu den Eigenschaften der Probe, durch die das Licht
hindurchtritt. Nach dem Lambert-Beerschen Gesetz gilt:
A die Absorption
der molare Absorptionskoeffizient (l mol -1 cm -1 )
c die Konzentration (mol l -1 )
l die Schichtdicke (cm)
Dieses Gesetz zeigt, dass die Absorption linear zur Konzentration verläuft, dies jedoch nur für niedrige Konzentrationen
gilt. Bei Absorptionswerten über 3 beginnt sich die Konzentration von einer linearen Beziehung zu entfernen.
Transmission ist der Anteil des Lichts, der durch die Probe hindurchtritt:
Daher gilt: T = I
t
I
o
Die Absorption ist umgekehrt proportional zur Transmission:
A = log 1
T
3.2 BESTIMMEN VON NUCLEINSÄUREN
DNA, RNA und Oligonucleotide können direkt in wässrigen Lösungen in verdünnter oder unverdünnter Form
gemessen werden. Wässrige Pufferlösungen mit geringen Ionenkonzentrationen (z. B. TE-Puffer) sind ideal für
diese Methode. Die Konzentration wird im Allgemeinen durch eine Messung bei 260 nm gegen eine Blindprobe
(Leerprobe) und dann durch Berechnung mit einem Faktor bestimmt.
Das Genova Plus verfügt über vordefinierte Methoden, bei denen davon ausgegangen wird, dass die Absorption von
1 OD (A) ungefähr 50 µg/ml dsDNA, 37 µg/ml ssDNA, 40 µg/ml RNA und 30 µg/ml für Oligonucleotide entspricht.
DNA-Interferenz durch Verunreinigungen kann durch die Berechnung eines Absorptionsverhältnisses abgeschätzt
werden. Die Verhältnisse A260/A280 und A260/A230 dienen zur Einschätzung der Reinheit von Nucleinsäuren,
da Proteine bei 280 nm und Substanzen wie Peptide, Phenole, aromatische Verbindungen und Kohlenhydrate bei
230 nm absorbieren. Reine DNA sollte ein A260/A280-Verhältnis von ungefähr 1,8 und reine RNA von 2,0 haben.
In reinen Proben von Nucleinsäuren sollte das A260/A230-Verhältnis ungefähr 2,2 betragen.
wobei:
I
o
das einfallende Licht
l
t
das transmittierte Licht
L die Schichtdicke
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I
o
I
t
L