Hoefer IEF100 - Handbuch (Seite 57)

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Anhang B: Reagenzien und Lösungen
Probenvorbereitung
Die Proben für die 2D vorbereitet sein sollten vollständig denaturiert,
frei von unlöslichen Material, und in insgesamt niedrigen Ionenstärke.
Einige Proteinproben wird leicht löslich, während andere schwer, die
zusätzliche Reagenzien (wie Thioharnstoff, spezielle Reinigungsmittel,
etc.), um die Solubilisierung zu fördern. Die allgemeine Klassen von
Additiven sind unten aufgeführt.
Vergällungsmittel
Harnstoff ist die häufigste Reagens in IEF zur Unterbrechung der
inneren Bindung des Proteins verwendet, so dass er sich zu entfalten.
Die Proben werden unter Verwendung von Harnstoff-Konzentrationen
von 8 bis 9,5 M. Im Allgemeinen, je höher die Harnstoffkonzentra-
tion besser ist eine Probe in Lösung gebracht werden kann. Urea
erreicht ihren Sättigungspunkt nahe 10 M bei Raumtemperatur.
Thioharnstoff wird auch verwendet, um besser zu solubilisieren
einige. Häufig wird 2 M Thioharnstoff mit 5-7 M Harnstoff als
Reagenz zur Probenvorbereitung und IPG Rehydratation kombiniert.
Wasch
Mehrere Arten von nicht-ionische oder zwitterionische Detergenzien
verwendet werden, um Proben (CHAPS, Triton X100, Nonidet NP-40
und alkylamidosulfobetaine Detergenzien) löslich zu machen. CHAPS
ist das am häufigsten verwendete Reinigungsmittel für 2D-Elektro-
phorese. Es ist in Lösung stabil. Detergenzien wie SDS sind nicht
kompatibel mit IEF, weil sie an die Proteine binden und maskieren der
Proteine nativen Ladung.
Reduktionsmittel
Dithiothreitol (DTT) wird häufig verwendet, um Proteine in IEF
zu reduzieren. DTT bricht in Lösung, so wird sie normalerweise
hergestellt und kurz vor der Verwendung. Andere Reduktionsmit-
tel, wie 2-Mercaptoethanol, kann Dithioerythritol (DTE) und Tribu-
tylphosphin (TBP) verwendet werden.
Andere
Trägerampholyten oder IPG-Puffer hinzugefügt werden, um in
Proteinlöslichkeit zu helfen und zu verhindern, Proteinfällung
während der Fokussierung werden. Konzentrationen von 0,5%-
2%(v/v) werden typischerweise verwendet. Trägerampholyten können
mit einer bestimmten Kennzeichnung Experimente stören. In diesen
Fällen sollten die Reagenzien dann aus der Probe Extraktionsschritt
weggelassen werden.
Gemeinsame Klassen von Zusatzstoffen
Vergällungsmittel
Klappen Sie die Proteine , die internen
nativen Gebühren aussetzen.
Nicht-ionischen Detergenzien
Machen Proben besser löslich, ohne
dass die Protein verantwortlich.
Reduktionsmittel
Hilfe für die internen Disulfidbrücken
weiter zu entfalten, die Proteine,
und dazu beitragen, die negativen
Auswirkungen der Oxidation von
Proteinen während der Rehydratation
und IEF.
Andere
Träger amphoytes, Proteasen, DNasen,
RNasen.