Leica Biosystems HER2 FISH System - 30 Test - Handbuch (Seite 10)

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Leica Biosystems Leica HER2 FISH System - 30 Test Bedienungsanleitung TA9217 DE-CE-Rev_D 08/04/2013
Signalbeurteilung und Auszählung
Zur Beurteilung der Signalqualität und Auszählung der HER2- und CEP17-Signale ist
folgendermaßen vorzugehen:
1. Beurteilung der Objektträgerqualität
Beurteilen Sie die Objektträgerqualität nach folgenden Kriterien:
• Signalintensität der Sonde: Das Signal sollte hell und leicht zu
beurteilen sein. Die Signale sollten entweder hell und von kompakter,
ovaler Form oder fädig, von diffuser ovaler Form sein.
• Hintergrund: Der Hintergrund sollte relativ frei von fluoreszierenden
Partikeln sein und dunkel oder schwarz erscheinen.
Bei unbefriedigender Darstellung der oben genannten Merkmale siehe
Fehlerbehebungshinweise (Tabelle 6). Wiederholen Sie den Assay
gegebenenfalls.
2. Erkennung der Zielsignale
Stellen Sie sicher, dass die richtigen Filter zur Analyse verwendet werden:
• Gewebeübersicht: Hybridisierungssignale sollten nur bei invasiven
Tumorzellen ausgezählt werden. Tumorzellen können im Allgemeinen
anhand ihrer Größe von normalen Zellen unterschieden werden: Sie sind
üblicherweise größer als normale Zellen, Lymphozyten und Epithelzellen.
Wählen Sie die Zielbereiche mithilfe von H & E-Färbung aus und markieren
Sie diese Bereiche nach dem FISH-Assay auf dem Deckglas.
• Fokustiefe: Stellen Sie die Fokustiefe ein, um die Tiefe der Fokusebene zu
bestimmen und sich mit Form und Größe der Zielsignale und Störsignale
vertraut zu machen.
1. Beurteilung
der Objekt-
trägerqualität
- Signalintensität
der Sonde
- Hintergrund
2. Erkennung
der
Zielsignale
- Gewebeübersicht
- Fokustiefe
3. Eignung der
Kerne
- Kernauswahl
3. Eignung der Kerne
Betrachten Sie den hybridisierten Bereich mit einem 20X Objektiv:
• Kernauswahl: Bestimmen Sie die Zielregion (anhand von H & E-Färbung
ermittelte Tumorzellen). Vermeiden Sie Bereiche mit unscharfen
Kerngrenzen oder nekrotischen Zellen.
• Auch Signale mit geringer Intensität und unspezifischem, störsignalreichem
Hintergrund oder zur Erkennung der Kerngrenze nicht ausreichender
Gegenfärbung sollten ignoriert werden. Nur Kerne mit deutlich
abgegrenzten Signalen sollten ausgezählt werden.
4. Signalauszählung
• Tumorübersicht: Prüfen Sie mehrere Tumorzellbereiche mithilfe eines
40X Objektivs, um mögliche Heterogenität zu berücksichtigen. Vermeiden
Sie Zielregionen mit schwachen Signalen und wählen Sie einen Bereich
mit guter Kernverteilung.
• Auszählung: Beginnen Sie die Analyse im oberen linken Quadranten des
ausgewählten Bereichs und zählen Sie unter Verwendung eines 100X
Objektivs und gemäß den nachfolgenden Richtlinien und den Angaben in
Abbildung 1 von links nach rechts die Signale innerhalb der Kerngrenze.
• Erfassen Sie alle Signale im Kern durch Fokussieren entlang der Z-Achse.
• Zählen Sie zwei Signale gleicher Größe, deren Abstand kleiner oder gleich
dem Signaldurchmesser ist, als ein Signal.
• Kerne ohne Signal oder mit Signalen nur einer Farbe sind nicht zu
berücksichtigen. Bewerten Sie nur die Kerne mit einem oder mehreren
FISH-Signalen jeder Farbe.
• Zählen Sie für jeden Kern die HER2-Signale und die CEP17-Signale.
Wechseln Sie nach Bedarf zwischen dem orangefarbenen (HER2), grünen
(CEP17), grün/orangefarbenen und DAPI/grün/orangefarbenen Filtersatz,
um beide Farben zu inspizieren.
4. Signal-
auszählung
- Tumorübersicht
- Auszählung